【ZT】实验：植物组织培养母液的配制与保存

一、实验目的
  使学生熟练掌握植物组织培养中各种成分或成分组的母液（比需要量大若干倍）的配制方法。
二、实验仪器
电 子天平（感量为0.0001g）、一般天平（感量为0.1g）、烧杯100mL 50 mL 25mL）、量筒（1000 mL 100 mL 50 mL）、容量瓶200 mL 100 mL 50 mL 25 mL）、细口瓶（500 mL 200 mL 100 mL 50 mL）、药勺、玻棒、电炉等。
三、实验试剂
  按培养基配方准备
四、实验原理
一）培养基的组成
培养基是植物组织 培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。自然状态下生长的绿色植物由于自身能进行光合作用，并且能合成植物生长发育所需的几乎所有有机成分，加上土壤中含有较全面的无机和有机营养成分，所以只需在适当的时候施加少量的无机和有 机肥（复合成分），植物就可良好的生长。目前所使用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。例如，White培 养基是Uspenski和Uspenskaia（1925）的藻类培养基演化的结果，被广泛用于根的培养；Cautheret培养基是建立在Knop营养 液(1865)基础上的。以后的培养基大部分是在White和Cautheret培养基的基础上改进而成。
就目前所使用的各种培养基而言，可将它们的成分划分为几大类，常用的有MS、 B5 、和White培养基等。
1．水 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。  
2．无机营养成分：
大量元素，主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种
微量元素：培养基的微量元素主要包括铁（Fe）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、氯（Cl）、硼（B）和钼（Mo）等。这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。
3. 有机营养成分（包括维生素，氨基酸及其它有机物质等）
维 生素：硫氨素（维生素B1）盐酸吡哆醇（维生素B6）和烟酸 在部分培养基中还添加维生素BX（氨酰苯甲酸）、维生素C（抗坏血酸）、维生素E（生育酚）、维生素H（生物素）、维生素B12（氰钴胺酸）、维生素 BC（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙和氯化胆碱等维生素。
氨基酸：甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（环己六醇）也是一些培养基的添加成分。
其他：在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物等。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。
  4. 碳水化合物 所有的植物组织培养基都需要有碳水化合物作为能源，用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，高者可达5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般应增加用量，而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性。
  5. 植物生长调节物质（常称为激素）：
生长素类有：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），2，4，5-T（2，4，5-三氯苯氧乙酸）等；
细 胞分裂素类主要有：从甜玉米未成熟种子或其他植物中分离到的玉米素[6-（4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基）嘌呤]。人工合成的细胞分裂素主要有 激动素（KT，6-呋喃氨基嘌呤）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、2IP（异戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成；
赤霉素：主要是GA3，虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的；
乙烯等。
6. 琼脂或其他支持物
除液体悬浮培养外，就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。一般浓度0.4%-1%，质量越差的琼脂用量越大。
  7. 其他添加剂（含天然提取物、抗生素等）
  活性炭 渗透调节剂   抗生素 抗氧化剂等
二）培养基的选择
选 择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。MS培养基适合于大 多数双子叶植物，B5和N6培养基适合与许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White培养基适合于根的培养。
五、实验内容与步骤
一）MS大量元素母液的配制
一般将大量元素分别配制成10倍的母液，使用时再分别稀释10倍。
依次分别称取：
      NH4NO3         16.5g          
      KNO3           19.0g            
KH2PO4         1.70g
MgSO4·7H2O     3.7g
CaCl2·2H2O     4.4g
共配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
二）MS微量元素母液的配制
一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取：
KI                 0.083g        
Na2MoO4·2H2O       0.025g
H3BO3             0.62g        
CuSO4·5H2O         0.0025g
MnSO4·H2O       1.69g          
CoCl2·6H2O         0.0025g
ZnSO4·7H2O       0.86g
配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。
分别称取
CuSO4·5H2O         0.05g         CoCl2·6H2O     0.05g
各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。
三）MS有机质母液的配制
      一般配制成100倍MS有机母液。
依次称取
肌醇   10g         盐酸硫胺素（VB1） 0.01g
烟酸   0.05g       甘氨酸       0.2g
盐酸吡哆醇（VB6）     0.05g
配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

四）MS铁盐母液的配制
一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取：EDTA二钠 3.73g 和FeSO4·7H2O 2.78g，配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
  所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。
五）几种生长调节物质的配制
  各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。
  母液的保存：一般将以上配制好的各种母液保存在4℃左右冰箱内。
六、实验注意事项
1.      称量要精确
2.      配制母液时要注意药品溶解的先后顺序，以免发生化学反应，使的产生沉淀。