【ZT】植物组培培养基及其配制

   　培养基好比土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地。因此，在组织培养基的各个环节中，应着重掌握培养基，了解它的组成和配制方法。
　　一、组成培养基的五类成分
　　目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。
　　1.无机营养物
　 　无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与 Na2—EDTA(螯合剂)的混合。
　　2.碳源
　　培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。
　　3.维生素
　　在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。
　　4.有机附加物
　　包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。另外，琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。
　　5.生长调节物质
　　常用的生长调节物质大致包括以下三类：
　　(1)植物生长素类。如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
　　(2)细胞分裂素。如玉米素(Zt)、6-苄基嘌呤(6-BA或BAP)和激动素(Kt)。
　　(3)赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸(GA3)。
　　二、常用培养基配方及其特点
　　1.常用培养基配方
　　组织培养是否成功，在很大程度上取决于对培养基的选择。不同培养基有不同特点，适合于不同的植物种类和接种材料。开展组织培养活动时，应对各种培养基进行了解和分析，以便能从中选择使用。下面介绍组织培养几种常用培养基的配方见表9－1。
　　培养基中的激素种类和数量，随着不同培养阶段和不同材料而有变化，因此各配方中均不列入。
　　2.几种常用培养基的特点
(1) MS 培养基。 MS培养基是目前普遍使用的培养基。它有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养， 它的液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显成功。这种培养基中的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，无须再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。与其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的明显特点。
　　(2)B5培养基。B5培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。经过试验发现，有些植物的愈伤组织和悬浮培养物在MS培养基上生长得比B5培养基上要好，而另一些植物，在B5培养基上更适宜。
　 　(3)N6培养基。N6培养基特别适合于禾谷类植物的花药和花粉培养，在国内外得到广泛应用。在组织培养中，经常采用的还有怀特 (While，1963)培养基、尼许(Nitsch，1951)培养基等。它们在基本成分上大同小异。怀特培养基由于无机盐的数量比较低，更适合木本植物的组织培养。
三、培养液的配制
　　1.制备母液
　　为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1 /1000，加以稀释，即成培养液。现将培养液中各类物质制备母液的方法说明如下。
　　(1)大量元素。大量元素包括硝酸铵等用量较大的几种化合物。制备时，按表中排列的顺序，以其10倍的用量，分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到1升，此即大量元素母液。
　　(2)微量元素。因用量少，为称量方便和精确起见，应配成100倍或1000倍的母液。配制时，每种化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。
　　(3)铁盐。铁盐要单独配制。由硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)5.57克和乙二胺四乙酸二钠(Na—EDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培养基，加铁盐5毫升。
　　(4)有机物质。主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是分别称量，分别配成所需的浓度(0.1～1.0毫克/毫升)，用时按培养基配方中要求的量分别加入。
　　(5)植物激素。最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用浓度很低，一般为0.01～10毫克/升。可按用量的100倍或1000倍配制母液，配制时要单个称量，分别贮藏。
　　配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用1～2毫升0.1N(克当量浓度)氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。配制细胞分裂素时，应先用少量0.5或1N的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。
　　以上各种混合液(母液)或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。
　　2.配制培养基的具体操作
　　①根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。
　　②将①中称好的琼脂加蒸馏水300～400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。
　　③将①中所取的各种物质(包括蔗糖)，加入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培养基。
　　④用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入③中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8。
　　⑤将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶(或试管)中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。
培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。成分单的格式与内容见表9－2。
　　3.培养基的灭菌与保存
　　培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在汽相120℃条件下，灭菌20分钟。如果没有高压蒸汽灭菌锅，也可采用间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。
　　经过灭菌的培养基应置于10℃下保存，特别是含有生长调节物质的培养基，在4～5℃低温下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基，要在配制后的一周内使用完，其它培养基最多也不应超过一个月。在多数情况下，应在消毒后两周内用完。