【ZT】实验：植物组织培养中的无菌技术

一、目的要求
通过实验掌握植物组织培养中的无菌操作技术。学习培养基的配制及灭菌，掌握植物外植体表面消毒的常规方法。
二、基本原理
近年来，植物组织培养作为一种研究技术已被广泛。植物组织培养是应用无菌操作方法培养植物器官或组织地任何一部分，甚至单个细胞的观察。植物组织培养中的无菌技术主要包括培养基的配制与灭菌。
1．MS培养基的配制：
对 植物外植体进行离体培养时，培养基提供生长所需的营养成分等。不同材料对培养基的要求不同，适当地设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功是至关重要的。另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控、次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现。培养基的主要成分包括无机营养物、碳源、维生素、植物生长物质和有机附加物等。植物生长物质是培养基中的关键物质，对外植体愈伤组织的诱导和分化起着重要的调节作用。配制培养基通常都按配方浓度的若 干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时按比例稀释。一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有机化合物母液。
2．培养基灭菌：
凡是暴露在（未经处理的）空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体都是有菌的。培养所用的培养基含有植物细胞生长 所必需的各类营养物质，也是各种细菌、真菌滋生繁殖的极好场所。组织培养必须采用无菌技术，在取材、接种、培养的整个过程中，必须严格进行培养基和培养材料的灭菌，同时，严格进行无菌操作，防止污染。
3．植物外植体消毒和接种：
用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进行消毒。从室外取的材料，一般先用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，自来水冲洗的时间要长，几个小时或过夜，并且用洗衣粉或洗洁精洗涤，必要时用毛刷刷洗。洗后的材料用滤纸擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤3～5遍，最后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两种消毒剂交替浸泡法。一般，首先用75％乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min或含有2％活性氧的次氯酸钠溶液5～30min，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌3～5min，无菌水漂洗3次后，切割、用于接种。
用消毒剂对接种材料进行灭菌处理时，可以在灭菌溶液中加入1～2滴表面活性剂，如吐温80或吐温20，它们可以湿 润外植体整个组织，促进灭菌液充分接触表面组织，达到较好的消毒效果。有时还可以用磁力搅拌、超声振动等方法使消毒杀菌剂进入外植体。消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。
三、器材
1．试剂：硝酸胺，硝酸钾，磷酸二氢钠，硫酸镁，氯化钙，硫酸铁，乙二胺四乙酸，2，4-D,BAlmol/L盐酸，lmol/L氢氧化钠、0.1％氯化汞（剧毒!）,75％乙醇无菌水，无菌培养皿，MS培养基。
2．器具：电子天平，冰箱，pH试纸，烧杯，量筒，试剂瓶，三角瓶，吸耳球，刻度吸管，洗瓶、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、各种接种工具、无菌纸、一次性手套、酒精灯、标签纸、记号笔、镊子、剪刀、解剖刀。
3.材料:胡萝卜块根、绿豆种子、非洲澎蜞菊叶片。
四、操作步骤
（一）培养基配制的一般操作程序是（图1－1,表1－1）：
1．大量元素母液的配制：

图1－1培养基配制操作程序
2．铁盐母液配制：按MS培养基配方所列FeSO4·7H2O和EDTA－Na2·2H2O含量扩大100倍进行实际称量，依大量元素母液的步骤，配制母液300mL，贴上标签，10℃保存。
3．植物生长物质母液配制：本实验分别配制500mg/L2,4-D和300mg/L6-BA母液。
4.培养基配制：见表1－2。
表1－1配制MS培养基母液种类

表1－2从MS培养基母液配制培养基

（二）植物外植体消毒和接种：
1．接种前，用75％乙醇棉球或用2％苯扎溴铵溶液擦拭超净工作台台面，将培养基及用具放入工作台，开超净工作台紫外灯照射至少20min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，再开日光灯进行无菌操作。
2． 将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，用小刀切去外围组织，切成小块分别放100mL烧杯中，用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液分别浸泡 2、5、10min，用无菌水洗涤3次，无菌纸吸干水分。取出培养皿，剪刀和镊子使用前插入90％乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却 后，切取髓部组织0.5cm。以上操作都要在试管口靠近火焰旁。
3．将培养容器斜面向上，并使它们拉于水平位置，也可将培养容器放在左手中。将塞 盖用右手拧转松动，以便接种时拔出。用火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口（靠手腕的动作，使试管口沾染的少量菌得以烧死）。将烧过的接种针（环）触动培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的外植体，然后轻轻接触外植体，慢慢将接种针（环）抽出试管，打开培养容器盖，将外植体放在培养基上，每瓶放3块。 封口，贴标签，注明姓名，标明时间和材料名称。整理好接种室（箱）的台面，搞好清洁卫生。
4．用水洗干净非洲澎蜞菊叶片，用滤纸擦干后置于100mL烧杯中，在超净工作台上加入75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％氯化汞溶液浸泡3、5、7min，用无菌水洗涤3次，将叶片切成长1cm,按照上述同样的步骤接种于培养基上。
5．绿豆种子用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％氯化汞溶液（加入吐温2滴）浸泡3、5、10min，期间不断搅拌溶液，用无菌水洗涤5～6遍，洗干种子外围水分，按照上述同样的步骤接种于培养基上。
五、实验报告
1.用表格表示高压消毒灭菌的效果，如培养基、工具的消毒数目和消毒2天后污染情况。
2.观察接种材料（叶片、种子或胡萝卜肉质根）接种后2～5天的污染情况，用表格表示接种材料的数目、污染的外植体数，并计算污染率。污染率（%)=（污染的材料数／总接种材料数×100%
如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间可能过长，组织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染，生长正常，即可以认为消毒剂使用浓度的适宜消毒时间。
六、思考题
1．高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”
时才开盖取物？
2．为什么要配制母液？各种母液扩大的倍数如何确定？
3．有时在培养基中加入活性炭、果汁、蔬菜汁，它们分别起什么作用？
4．植物生长物质为什么要单独配制母液？
5．外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？为什么常在消毒溶液中加入1～2滴表面活性剂（如吐温）?
6．在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具、接种材料的污染？3．对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”?