“新筛”干血斑在耳聋基因检测中的应用

　　摘要：目的 将新生儿遗传代谢病筛查（简称“新筛”）后剩下的干血斑继续用于耳聋基因提取和飞行质谱检测，从而减少耳聋基因检测过程中的取样频次并缩短检测周期。方法 在碱水煮沸法提取耳聋基因的基础上优化碱水的pH值和用量，使“新筛”干血斑DNA提取浓度达到新鲜血斑水平。结果 用pH值为9、10、11、12的碱水从干血斑中提取DNA时，DNA的浓度与碱水pH值呈正相关（r=0.906,P=0.094),20个耳聋基因位点均能被正常检出；当pH值达到12时，质谱峰图信号响应值减小，检测质量下降。用60、70、80、90μL pH值为11的碱水从“新筛”干血斑中提取DNA时，DNA浓度与碱水体积呈负相关（r=-0.988,P=0.012）；用90μL pH值为11的碱水时，有1例样本547G>A位点基因被漏检，用80μL pH值为11的碱水时，DNA提取浓度和新鲜血斑最接近（t=0.035,P=0.974），同时质谱峰图良好。结论 用80μL pH值为11的煮沸碱水从“新筛”干血斑中提取DNA，可获得较好的耳聋质谱检测结果，为搭建“新筛”和耳聋自动化检测平台提供一定的技术参考。
　　关键词：干血斑; 新生儿遗传代谢病筛查; 耳聋; 提取;

　　目前，干血斑除被广泛应用于各种新生儿遗传代谢病筛查（“新筛”）检测，在基于飞行质谱或测序平台的人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）、耳聋、地中海贫血等基因检测领域也有所应用。我国每年有1‰～3‰的新生儿存在听力损失，而其中约50%因遗传导致[1]，新生儿耳聋基因检测对指导和干预迟发性和药物性耳聋具有重要意义[2]。目前，“新筛”在我国东部地区已实现普及，西部地区的普及率也快速提高，部分地区的“新筛”费用已被纳入各类医保体系中[3]。因此，通常需要处理大量需要同时做“新筛”和耳聋基因检测的干血斑样本，因此同一个采血卡样本会被反复打孔取样以完成不同类型的检测，极大地增加了试验人员的工作量，甚至会出现因频繁取样使样本不足而无法完成检测的现象，为疾病筛查带来诸多不便。
　　“新筛”需要提取血斑中的氨基酸和肉碱等胞外物质，耳聋基因检测需要提取细胞内的核酸，两者的目标检测物及其分布场所互不相同，因此本研究提出按先后顺序依次提取同一个干血斑中胞外和胞内产物，提取产物分别用于“新筛”和耳聋检测。然而，基于串联质谱的“新筛”检测通常先用甲醇提取干血斑中的代谢产物[4]，而甲醇可稳固细胞结构[5]，使细胞裂解的难度增大，给后续耳聋基因提取带来一定困难。因此，为避免反复取样，本研究在碱水煮沸法提取干血斑DNA的基础上进一步优化提取条件，以期实现用1个血斑先后完成“新筛”和耳聋的产物提取和检测，从而提高筛查中心的检测效率，促进自动化检测平台的搭建。


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