免疫共沉淀技术实验过程应注意的问题

1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。

 

（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用

 

（3）使用对照抗体：

 

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

 

兔多克隆抗体：正常兔IgG

 

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：

 

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

 

(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

 

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

 

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