200 ug／ml蛋白酶K

三种方法检测耐甲氧西林葡萄球菌方法的评价

【关键词】 耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；头孢西林纸片扩散法；微量稀释法

　　［摘要］ 目的：评价3种检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)方法的临床应用价值。方法：用头孢西丁纸片扩散法，苯唑西林微量稀释法和PCR检测mecA基因对临床分离98株葡萄球菌进行检测并作比较。结果：98株中有63株耐甲氧西林葡萄球菌，3种检测方法差异无显著性。结论：头孢西丁纸片扩散法可作为基层医院微生物实验室日常工作检测甲氧西林的简便又准确的实验方法 。

　　［关键词 耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；头孢西林纸片扩散法；微量稀释法

　　葡萄球菌是人类感染的最重要的病原菌之一［1］，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin　resistant staphylococcus aureus ，MRSA)所造成的院内感染一直是临床普遍关注的问题，而凝固酶阴性的耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant oaagulase megative staphylooocci，MRCNS)近年来报道增多，其耐药性比凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌更高 ，造成临床治疗上的困难。由耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant staphylooocci，MRS)引起的感染已经成为临床抗感染治疗的难题之一。怎样快速、准确地检测出MRS及预测其耐药性变化对临床治疗及合理应用抗生素都有十分重要的意义。为此，我们对MRS的检测方法进行了探讨，现报告如下。

　　1　材料与方法

　　1．1　材料

　　1．1.1　菌株来源　收集了2005年9月至12月本院临床科室各类标本中分离的葡萄球菌共98株，并经血浆凝固酶试验和法国生物梅里埃公司生产的VITEK32全自动微生物分析仪系统，配套的GPI和GNI细菌鉴定板鉴定，严格按照细菌鉴定程序进行 。金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923。

　　1．1.2　主要试剂　GPI细菌鉴定板和GPS药敏板条为法国生物梅里埃公司产品。头孢西丁(30 μg)纸片为英国OXOID公司商品，药敏试验所用培养基MuelleHinton(MH)琼脂购自杭州微生物试剂厂。mecA基因检测引物由上海生物工程公司合成。

　　2　方法

　　2．1　最低抑菌浓度(MIC)测定　用GPS-109药敏鉴定卡在Vitek32全自动微生物分析/药敏系统测定苯唑西林MIC，遵循美国临床和实验室标准化研究所CLSI制定的判断标准。

　　2.2　头孢西丁纸片扩散试验　按CLSI推荐的Kirby-Bauer法进行 ，菌液浓度0.5麦氏浊度(1 .5×108 CFU／ml)。结果判断标准：金黄色葡萄球菌抑菌圈直径≤19 mm为耐药，≥20 mm为敏感，凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径≤24 mm为耐药，≥25 mm为敏感。

　　2．3　PCR检测mecA基因　挑取菌落置入内含有100 μl生理盐水的0.5 mL离心管内，离心(15 000 r／min)5 min吸弃上清液加裂解液A(0.5%非离子去污剂)50 μl和裂解液B(200 ug／ml蛋白酶K)5 μl置55 ℃保温1 h后置入95 ℃保温5 min。离心(10 000 r／min)30 s ，上清液即为模板。PCR引物序列P1(5’-GCAATCGCTAAAGAACTAAG-3’)，P2(5’-AATGGGACCAACATAACCTA-3’)，PCR反应体系50 μl，热循环参数为：94 ℃预变性5 min,94 ℃1 min，48 ℃1 min，72 ℃1 min，循环30次，72 ℃延伸10 min，PCR扩增产物作2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶电泳成像仪下观察，以224 bp处出现荧光条带为mecA基因阳性。金葡菌ATCC 25923作为阴性对照，阳性对照模板DNA由上海生物工程公司提供。

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