毛细管用0.1 mol/L氢氧化钠充满浸泡过夜

摘要 建立了毛细管电泳吡啶钌电化学发光技术测定中药天仙子中二种生物碱的方法。考察了进样条件、分离条件以及检测条件对样品分析的影响。在优化的条件下: 检测电位1.2 V; 分离缓冲溶液pH 8.48; 检测池缓冲溶液pH 7.48 ; 进样高压12 kV; 进样时间9 s, 阿托品在0.29 mg/L -5 .8 mg/L、东莨菪碱在3.0 mg/L-303 mg/L范围内呈良好线性关系(相关系数 0 .997以上)。 阿托品和东莨菪碱检测限分别为：0.014 mg/L、0.03 mg/L。本方法具有样品用量少、灵敏度高、线性关系好、选择性好等优点，能有效避免中药样品提取物中干扰物质的影响, 已成功地用于中药天仙子中生物碱的检测。
关键词 毛细管电泳 电化学发光 检测 天仙子
1 引言
天仙子是一种传统的天然中草药，为茄科植物茛菪干燥成熟种子。具有行气活血, 利水消肿的功能。用于脘腹刺痛, 关节痹痛, 妊娠水肿等病症的治疗。近年来, 还发现天仙子对癌症治疗有独特的疗效。天仙子两种主要活性成分为阿托品和东莨菪碱，文献报道这两种活性成分的分析方法有：核磁共振技术[1]、紫外分光光度法[2]、高效液相色谱法[3-6]和毛细管电泳分离等技术[7，8 .9]。尽管毛细管电泳（CE）技术具有进样体积小 , 操作费用低廉, 可以提供高分离效率等优势。但由于CE 进样量微小, 因此CE 方法所面临的主要挑战是寻找与之相匹配的检测方法，以提高待分析物的检测灵敏度。电化学发光（ECL）是通过电化学方法产生某些特殊物质，然后这些电生物质之间或电生物质与其它物质之间进一步反应而产生发光，从而把电能转化
为光辐射能的一种分析手段[10]。研究表明电化学发光是一种灵敏度高、选择性好的检测方法[11.12]。在众多的电化学发光体系中, Ru(bpy)32+电化学发光具有试剂稳定性高、水溶性好、引发电势值适当、激发态寿命长、发光效率高、反应无须除氧以及Ru(bpy)32+可循环再生等优点[13.14]， Ru(bpy)32+电化学发光已成为研究最多的分析体系。作为一种高度灵敏的检测技术，Ru(bpy)32+电化学发光被成功地应用于样品痕量分析 ，有关它的应用被广为综述[15-17]。CE 与三联吡啶钌电化学发光技术联用（CE-ECL）将二者的优势有机组合，已成为分析化学领域中强有力的分析工具[18]。
本文采用CE-ECL分析技术，检测中草药天仙子中的二种生物碱,具有灵敏度高、样品用量少、选择性高等特点。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
毛细管电泳电化学发光综合分析仪（西安瑞迈电子科技有限公司，中国）。ECL 检测采用三电极系统：直径500 μm Pt 盘工作电极、Ag/AgCl 饱和参比电极、Pt 丝对极。未涂层石英毛细管52 cm×25 μm i d（河北永年光学纤维厂，中国）。Ru(bpy)32+六水合氯化物(Aldrich，DOI: 10.3724/SP.J.1096.2010.009152010, 38(6):915美国）。硫酸阿托品和氢溴酸东莨菪碱（Sigma，美国）。磷酸盐、氢氧化钠、氯仿和石油醚
均为分析纯。二次蒸馏水采用Mili-Q 超高纯净水体系（Milipore, 美国）制备，所有溶液均用二次蒸馏水配制。中药天仙子购于长春市药材公司。
2.2 实验方法
毛细管用0 .1 mol/L氢氧化钠充满浸泡过夜。电泳分离之前，分别用0.1 mol/L氢氧化钠、二次蒸馏水、缓冲液冲洗毛细管各10 min。ECL检测池构造如先前文献报道[19]，池中添加5mmol/L Ru(bpy)32+、50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.48），池中溶液3 h后更换一次,以保持实验重现性。本实验采用柱端ECL检测模式，借助光学显微镜准直工作电极与毛细管出口端，并固定二者距离为150 μm。电动进样12 kV×9 s，分离缓冲溶液pH 8. 48，检测电位1.2 V，光电倍增管偏置电压800 V。
2.3 天仙子中生物碱的提取
取约0.5 g 碾成粉末状的天仙子准确称重，加入5 ml 石油醚超声20 min，弃掉石油醚层。加入4 mL 氯仿超声20 min，萃取过程重复两次。提取液合并后挥干，残余物用二次水溶解，经0 .45 μm 醋酸纤维膜过滤，滤液储存于4 °C 冰箱中备用。
3 结果与讨论
3.1 分离检测条件的优化
3.1.1 检测电位的影响
ECL 检测方法的显著优势在于其电化学发光反应的可控性，合适的检测电位是生物碱与吡啶钌ECL 共反应的基础。利用CE-ECL 体系，在1.1 V ~ 1.3 V 范围内考察检测电位对阿托品和东莨菪碱ECL 反应的影响。由图1 可见随着激发电位的升高，两种成分的ECL 强度逐渐增强。1.2 V 时ECL 强度达到最高值。继续增高检测电位，ECL 强度反而呈下降趋势。(1)、(2) 分别是阿托品和东莨菪碱的ECL 强度随检测电位变化的曲线。

图1 检测电压对ECL 强度的影响Fig. 1 Effect of detection potential on the ECL intensity曲线a: 10-5 mol/L 阿托品的ECL 强度（atropine）；曲线b: 10-4 mol/L 东莨菪碱的ECL 强度(scopolamine)。检测池底液：5 mmol/L Ru(bpy)32+ + 50 mmol/L 磷酸盐（phosphate） ；电动进样（electrokinetic injection）7 s×10 kV ；分离电压（separation voltage）15 kV。
3.1.2 分离缓冲溶液pH 值的影响 Related articles: