荧光探针的基本概念

在描述荧光探针时常用到下述的一些基本概念，在选择使用荧光探针时应予考虑。
（一）荧光的激发波长和发射波长
　　荧光探针大多是含有共扼双键体系的有机化合物，容易吸收近紫外区或可见光区的激发光，而发射出可见光区的光。荧光探针只能吸收或发射一定波长范围内的光。探针的发射波长总是大于其激发波长，该波长差值称为Stokes位移。
　　激发光谱指某种荧光物质在不同波长的激发下所测得的同一波长荧光强度的关系，即不同激发波长的相对效率。而发射光谱指该物质在某一固定波长激发下所测得的不同波长荧光强度的关系，即不同发射波长的相对效率。激发光谱的长波部分和发射光谱的短波部分常重叠，这是分子内部能量转换的结果。如图所示，相应于不同波长（EX1、EX2和EX3）的激发并不改变荧光的发射光谱，但其发射光（EM1、EM2和EM3）强度与激发光强度有关。



（二）荧光强度
　　荧光强度是表示荧光相对强弱的参数，它决定了检测的灵敏度。其表达式为：



　　式中，F为荧光强度；K为仪器常数；Q为荧光量子产率； | | | | I0为激发光的强度；ε为摩尔吸收系数；b为样品池的光径（样品厚度）；c为样品浓度。
　　摩尔吸收系数ε指染料吸收激发光的能力，而量子产率Q在数值上等于发射量子数与吸收量子数的比值，它与发射强度直接相关。各种荧光探针在（0.1, l）区间内有一个特征的量子产率，而只有当Q >0.4时才有实用意义。
（三）荧光寿命
　　荧光寿命又称激发态寿命，指荧光探针分子在激发态的平均停留时间（τ）。大多数荧光探针的荧光寿命在纳秒级。例如，FITC的τ值为4ns。荧光寿命短则可提高灵敏度。
（四）荧光探针的环境因素
　　适宜的溶剂极性、合适的pH值、猝灭剂浓度及其与探针分子的亲和性以及环境温度等环境因素都会影响到荧光探针的产率。因此，应根据实验要求选择合适的探针和使用条件。
在选择使用合适的荧光探针时应注意的两个问题如下述。
　　1 ．最大吸收波长或最大发射波长
　　应结合现有仪器的激光光源可以提供的工作波长，选择可供使用的荧光探针，并选用相应的滤光片。
　　2 ．光漂白
　　光漂白（photobleaching）也称光褪化效应（fading-out effect），使用时应尽量避免过度强光或长时间照射，以免缩短样品使用寿命。
　　下表为常用于生物医学显微技术中的荧光探针，仅供参考。应该指出的是，新的荧光探针不断地被合成生产出来，在种类和性能上不断更新，可供选择的可能性在不断扩大。具体可以参考有关厂家的说明材料或专著如“handbook of fluorescent probes and research chemicals”（由美国Richard P . Haugland 著，Molecular Probes公司出版）。