·基础论著·
特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体的制备及其基因序列分析
李娅杰 彭劲民 张奉春
基金项目：国家自然科学基金资助项目（项目号：39970698）
作者单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫科（李娅杰、彭劲民、
张奉春）
通信作者：张奉春,E-mail:zhangsamfc@hotmail.com
【摘要】 目的 由已构建的人源单链可变区噬菌体抗体库中制备出抗SSA/Ro单克隆抗体，并对这些抗体的基因序列进行分析。方法 将冻存的抗体库菌种复苏制备噬菌体抗体库。用PCR、基因序列分析及酶切的方法对其进行鉴定。以组织培养皿法对该噬菌体抗体库进行富集筛选，用ELISA方法对富集后次级抗体库进行鉴定。制备单克隆抗体并鉴定其特异性，对单克隆抗体的可变区基因序列进行测序分析。结果 所制备的噬菌体抗体库的滴度为1.6×1012 cfu/ml，外源基因的插入重组率为80％，插入片断为人抗体可变区基因，且该抗体库具有良好的多样性。富集筛选回收的噬菌体数逐渐增加，富集后的抗SSA/Ro噬菌体抗体次级库吸光度（A）值为富集前的2.8倍，且该次级库有良好的抗SSA/Ro特异性。经富集制备出5个特异性抗SSA/Ro单克隆抗体，这些单克隆抗体重链及轻链可变区基因分别与VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3基因家族有高度同源性。结论 本实验室构建的scFv噬菌体抗体库可以用于特异性抗体的筛选及单克隆抗体的制备。制备出的抗SSA/Ro单克隆抗体可变区基因序列与人胚系基因比较有突变，为研究相关疾病的发病机理开创了新的途径。
【关键词】 自身抗体； 噬菌体； SSA/Ro抗原； 单克隆抗体； 基因序列
抗SSA/Ro抗体是多种自身免疫病的重要自身抗体，并与一些特异临床表现密切相关，具有直接的致病作用［1］。获得不同的抗SSA/Ro单克隆抗体有助于解释相关疾病的发病机制，指导临床。噬菌体抗体库技术是近十余年来发展起来的用于制备抗体的突破性技术，用此技术可快速制备含有目的基因的单克隆抗体［2］。我们用此技术已经构建了一个人源单链可变区（single-chain Fv, scFv）噬菌体抗体库［3］。本实验将先对其进行鉴定，再用纯化的天然SSA/Ro抗原对其进行筛选，建立一个特异的抗SSA/Ro次级噬菌体抗体库，挑选出特异的抗SSA/Ro单克隆抗体，并对这些抗体的DNA序列进行分析，为进一步研究抗原抗体相互作用奠定基础。
材料与方法
一、材料
1.scFv噬菌体抗体库：为本实验室构建，来自抗SSA/Ro抗体阳性患者外周血单个核细胞。库容为3.0×107 cfu，外源基因插入率为91%［2］。
2.细菌菌株、辅助噬菌体及载体： E. coli TG1为本实验室保存，基因型：supE hsd△5thi（lac-proAB）F′［traD36proAB+lacZ△ M15］。噬菌粒载体pHEN2由英国剑桥大学分子研究中心Winter G.教授惠赠。辅助噬菌体M13K07为瑞典phamacia公司产品。
3.纯化的天然抗原:SSA、SSB、Sm、Scl-70、ⅡbⅢa为本实验室保存。
二、方法
1.scFv噬菌体抗体库的初步鉴定：（1）噬菌体scFv抗体库的制备：取冻存文库菌种复苏，转入含100 μg/ml氨苄青霉素及2%葡萄糖的2×YT培养液中，37℃振荡培养使A≈0.5， 加入辅助噬菌体K13M07，37℃培养1 h。离心沉淀感染的细胞，重悬菌体于含100 μg/ml氨苄青霉素及70 μg/ml卡那霉素的2×YT培养液中，37℃培养过夜。离心取上清，加入1/5体积的PEG8000至4%，NaCl至3%，冰浴中静置30 min。离心，用含1%BSA 的PBS重悬沉淀，瞬时离心后收集上清即为scFv噬菌体抗体库。（2）抗体库插入片段完整性的鉴定：随机挑选10个分隔良好的单菌落，用于提取噬菌粒 DNA（采用美国Promega公司质粒提取试剂盒cat.A1330，按说明书操作）。其后进行插入片段的PCR扩增（PCR扩增引物LMB3： 5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′FdSeq：5′-GAA TTT TCT GTA TGA GG -3′）。PCR扩增产物电泳，观察扩增条带的位置及亮度。（3）重组体可变区（variable region, V区）基因序列的测定：从已鉴定含有正确长度外源基因的克隆中随机挑选4个以双脱氧末端终止法在全自动测序仪进行DNA测序（重链V区测序引物：FOR LinkSeq：5′-GCC ACC TCC GCC TGC TGA ACC -3′; 轻链V区测序引物：PHEN-SEQ： 5′-CTA TGC GGC CCC ATT CA-3′），测序仪器为ABI PRISM 377-96。测序结果在Internet 上用BLAST软件将测序所得重链、轻链序列分别与Gen Bank中的人免疫球蛋白（Ig）数据库及英国剑桥V BASE抗体基因库比较分析。（4）抗体库多样性分析：将噬菌体单链抗体库中8个克隆的scFv插入片段的PCR扩增产物用限制性内切酶MSPⅠ消化，分 析酶切图谱。
2.特异性抗SSA 噬菌体抗体库的富集筛选：以浓度为50 μg/ml的纯化天然SSA抗原包被组织培养皿（NUNC, cat No. 153066），3%BSA-PBS封闭后加入抗体库1 ml，37℃孵育2 h。TBST洗液（Tris 50 mmol/L, NaCl 150 mmol/L, Tween20 0.5%, BSA 1%, pH= 7.5）洗涤10次，PBS洗涤10次（第2、3三轮各重复20次），pH=2.2甘氨酸-盐酸洗脱液，加入2 mol/L Tris以中和洗脱下来的噬菌体溶液，而后感染对数生长期的TG1菌液（A=0.8～1.0），取部分菌液测产出量，其余菌液进行下一轮筛选，共进行3轮。
3.特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体库的鉴定：（1）抗原结合活性的检测：使用抗SSA/Ro抗体ELISA检测试剂盒（英国GENESIS公司，Lot No. 13977）对未经过富集的初级噬菌体抗体库及经过3轮富集后的各次级文库进行检测，按说明进行操作，其中酶标2抗为瑞典Parmacia公司的专用于检测重组噬菌体抗体的HRP/anti-M13单克隆抗体。酶标仪于450 nm测A。（2）抗原结合特异性的检测：以纯化的SSA、SSB、Sm、Scl-70、ⅡbⅢa（抗原浓度均为1 μg/ml）及3%浓度的BSA为抗原包被酶联板，0.5%明胶封闭，分别加入100 μl/孔经过3轮富集后的抗体次级库及用于阴性对照的M13K07液（均用封闭液作1∶2稀释）室温孵育30 min。洗板，加入HRP标记抗M13噬菌体抗体，100 μl/孔，室温孵育30 min。洗板，加入酶底物TMB，100 μl/孔，室温孵育15 min。加入2 mol/L H2SO4 100 μl/孔终止反应，酶标仪于450 nm测A。
4. 抗SSA/Ro单克隆噬菌体抗体的制备及其特异性鉴定：随机挑选52个经过3轮富集后单菌落，按前述方法获得在噬菌体表面展示有scFv的单克隆抗体。用 英国GENESIS公司抗SSA/Ro抗体ELISA检测试剂盒检测它们与SSA/Ro抗原的结合活性；以纯化的SSA、SSB、Sm、Scl-70、Ⅱ bⅢa（抗原浓度均为1 μg/ml）及3%浓度的BSA为抗原，用间接ELISA法检测它们对SSA/Ro抗原的结合特异性（方法同前）。
5.单克隆抗体V区基因序列的测定：从已证明为特异SSA/Ro单克隆噬菌体抗体的5个克隆进行DNA测序分析（测序引物及方法同前）。
表1 克隆Y1、Y4、Y6、Y8的VH和VL基因与人胚系V区基因的比较分析
|
scFv |
VH基因特点 |
VL基因特点 |
|||||||
|
VH基因家族 |
最相似VH基因 |
与胚系基因同源性(%) |
DH |
JH |
VL基因家族 |
最相似VL基因 |
与胚系基因同源性(%) |
JK |
|
|
Y1 |
VH4 |
VH4-4 |
89 |
DH3-3 |
JH3 |
VK3 |
A27 |
96 |
JK2 |
|
Y4 |
VH4 |
VH4-34 |
98 |
DH3-16 |
JH6 |
VK3 |
A27 |
94 |
JK4 |
|
Y6 |
VH4 |
VH4-59 |
98 |
DH3-9 |
JH5 |
VK2 |
A3 |
96 |
JK1 |
|
Y8 |
VH4 |
VH4-59 |
92 |
DH3-16 |
JH4/5 |
VK3 |
A27 |
93 |
JK1 |
结果
一、scFv噬菌体抗体库的初步鉴定
1.scFv噬菌体抗体库的制备：1 ml冻存文库菌种复苏后含菌落2.2×1011 cfu，经M13K07超感染得到噬菌体抗体库的滴度为1.6×1012 cfu/ml。
2.抗体库插入片段完整性的鉴定：随机挑选10个菌落提取质粒进行插入片断的PCR扩增鉴定，其中8个克隆的产物在800～1000 bp处可见明显的扩增带，与文献报道的scFv基因片断大小一致。PCR扩增结果示复苏后的噬菌体抗体库中scFv片断插入重组率为80％。
3. 重组体V区基因序列的测定：从已鉴定含有正确长度外源基因的克隆中随机挑选4个克隆进行重链及轻链V区DNA序列测定，并将所得测序结果与人胚系V区基因 进行比较分析(表1)。分析发现各骨架区均符合人抗体相应骨架区特征，提示均为人抗体基因，证明基因的拼接、克隆均获成功。4个克隆的重链V区均属VH4 基因家族，其中3个克隆的轻链V区基因片段均与胚系基因片段A27（属VK3家族）有高度同源性。克隆Y6的轻链基因则属于VK2基因家族。
4.噬菌体抗体库多样性鉴定：8个重组噬菌粒的scFv PCR产物酶切结果呈现多样性的酶切图谱（图1）。提示此抗体库有很好的多样性，通过它可以获得针对多种抗原表位的抗体。
M 100bp DNA标记；1～8 单个重组噬菌粒的PCR产物经MSP Ⅰ酶切后的指纹图
图1 scFv重组噬菌粒酶切多样性
二、噬菌体抗体库的富集筛选
共进行了3轮富集筛选，每轮洗脱下来的噬菌体量逐渐增加，提示有特异性的富集（表2）。
三、特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体库的鉴定
1.抗原结合活性的检测：ELISA检测结果显示富集后的抗体库为富集前抗体库A的2.8倍（P/N大于2.1时判为阳性，P/N为待测样品吸光度/阴性对照吸光度）。这表明抗SSA噬菌体抗体得到了特异性的富集，富集后的次级噬菌体抗体库与SSA/Ro抗原有良好的结合活性。
2.抗原结合特异性的检测：ELISA检测结果显示该次级噬菌体抗体库与SSA/Ro抗原有特异结合（A为0.271，P/N值为4.44），而与其他5种抗原无明显结合活性。提示其为特异的抗SSA/Ro噬菌体抗体库（表3）（P/N大于2.1时判为阳性）。
表2 富集筛选对噬菌体抗体的富集效应
|
筛选次数 |
投入噬菌体量 (× 1011cfu) |
产出噬菌体量 (×106cfu) |
*收获率 （×10-4%） |
|
1 |
1.6 |
7 |
0.44 |
|
2 |
1.3 |
14 |
1.08 |
|
3 |
1.0 |
17 |
1.7 |
注: *收获率=产出噬菌体量/投入噬菌体量；cfu为菌落形成单位
表3 富集后次级抗体库与不同抗原结合反应的ELISA 结果
|
抗原名称 |
A |
P/N |
||
|
空白 |
阴性对照 |
次级抗体库 |
||
|
SSA/R |
0.059 |
0.061 |
0.271 |
4.44 |
|
SSB |
0.061 |
0.060 |
0.065 |
1.08 |
|
Sm |
0.065 |
0.064 |
0.065 |
1.02 |
|
Scl-70 |
0.064 |
0.060 |
0.077 |
1.28 |
|
ⅡbⅢa |
0.055 |
0.058 |
0.062 |
1.07 |
|
BSA |
0.058 |
0.061 |
0.065 |
1.07 |
注：A为吸光度；P/N＝(A次级抗体库-A空白)/(A阴性对照-A空白)
表4 克隆P27、P28、P34、P46、P50的ELISA结果
|
克隆 |
SSA/Ro |
SSB |
Sm |
Scl-70 |
ⅡbⅢa |
BSA |
||||||
|
A |
P/N |
A |
P/N |
A |
P/N |
A |
P/N |
A |
P/N |
A |
P/N |
|
|
空白 |
0.046 |
- |
0.060 |
- |
0.070 |
- |
0.064 |
- |
0.310 |
- |
0.337 |
- |
|
对照 |
0.050 |
- |
0.064 |
- |
0.067 |
- |
0.066 |
- |
0.305 |
- |
0.304 |
- |
|
P27 |
0.216 |
4.32 |
0.062 |
0.97 |
0.079 |
1.18 |
0.064 |
0.97 |
0.352 |
1.15 |
0.339 |
1.12 |
|
P28 |
0.202 |
4.04 |
0.058 |
0.91 |
0.072 |
1.07 |
0.062 |
0.94 |
0.368 |
1.21 |
0.385 |
1.27 |
|
P34 |
0.269 |
5.38 |
0.060 |
0.94 |
0.083 |
1.24 |
0.063 |
0.95 |
0.344 |
1.13 |
0.251 |
0.83 |
|
P46 |
0.138 |
2.76 |
0.069 |
1.08 |
0.071 |
1.06 |
0.060 |
0.90 |
0.380 |
1.25 |
0.264 |
0.87 |
|
P50 |
0.201 |
4.02 |
0.075 |
1.17 |
0.118 |
1.76 |
0.064 |
0.97 |
0.401 |
1.31 |
0.335 |
1.10 |
注：同表3
表5 5个克隆的VH和VL基因与人胚系可变区基因的比较分析
|
scFv |
VH基因特点 |
VL基因特点 |
|||||||
|
VH基因家族 |
最相似VH基因 |
与胚系基因同源性 |
DH |
JH |
VL基因家族 |
最相似VL基因 |
与胚系基因同源性 |
JK |
|
|
P27 |
VH1 |
VH1-46 |
99 |
D4-17 |
JH3 |
VK1 |
O2 |
92 |
JK2 |
|
P28 |
VH3 |
VH3-30 |
93 |
D2-21 |
JH4 |
VK1 |
L1 |
97 |
JK2 |
|
P34 |
VH3 |
VH3-48 |
88 |
D4-23 |
JH6 |
VK3 |
A27 |
92 |
JK5 |
|
P46 |
- |
- |
- |
- |
- |
VK2 |
A3 |
99 |
JK1 |
|
P50 |
VH4 |
VH4-39 |
94 |
D3-9 |
JH5 |
VK3 |
A27 |
96 |
JK2 |
四、抗SSA/Ro单克隆噬菌体抗体的制备及其特异性鉴定
随机挑选52个经过3轮富集后的单菌落，制备出单克隆抗体。用ELISA方法检测后证明有5个克隆与SSA/Ro抗原特异结合而不与其他抗原结合（P/N大于2.1时判为阳性）（表4）。
五、单克隆抗体V区基因序列的测定
将证明含特异抗SSA/Ro 抗体基因的5个菌株进行DNA测序分析，证明4个克隆的重链可变区分别属VH1、VH3、VH4基因家族，克隆P46重链可变区缺失；5个克隆的轻链可变 区基因分析显示：2个克隆（P34、P50）的VL基因片段均与胚系基因片段A27（属VK3家族）有高度同源性，克隆P27、 P28均属于VK1家族，克隆P46属于VK2家族（表5）。
讨论
自身抗体在疾病发生中的具体作用机制需要以单克隆自身抗体为研究工具来探讨，获得抗SSA/Ro单克隆自身抗体及抗体基因序列也为探索相关疾病的免疫封闭治疗及基因修复治疗提供了有利的工具。
本实验结果表明从这个未经富集的抗体库中随机挑选的4个克隆的VH均属VH4家族——提示VH4家族可能与自身抗体产生有特别的相关性。这一结果与Pascual等［4］的研究一致。但是，经富集后获得的单克隆抗体VH基因分析表明它们来源于多个基因家族，考虑原因可能为：抗体产生为抗原驱动下的克隆选择和亲和力成熟过程，富集筛选模拟了体内这一过程，同时由于抗原驱动导致抗体基因变异，呈多家族性。
关于抗SSA/Ro单克隆抗体及其基因序列的分析目前国际上相关文献报道较少，我们所检索的文献中尚无针对天然SSA/Ro抗原的抗体基因序列分析的报道。1991年Geng等［5］用EB病毒转化健康人B淋巴细胞获得了1个IgM型抗体，该抗体可与SSA/Ro及SSB/La特异结合，对其进行测序分析重链V区基因属VH4家族。1997年日本学者［6］通过用重组的60 000 SSA/Ro抗原从噬菌体抗体库中制备出3个抗60 000 SSA/Ro Fab单克隆抗体，其重链V区来自VH5、VH3家族，轻链V区来自Vκ2、Vκ3家族。1999年美国学者［7］用 杂交瘤技术制备了2株针对重组52 000 SSA/Ro的IgG型单克隆抗体，其重链V区基因均来自VH3家族，轻链V区分别来源于Vλ2家族及Vκ1家族。综上所述，抗SSA/Ro抗体可变区基 因可来源于VH3、VH4、VH5、Vλ2、Vκ1、Vκ2、Vκ3等不同基因家族，与我们的研究（属于VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3 基因家族）相似。考虑结果略有差别可能与抗体类型、获得的方法、驱动抗体产生的抗原来源各有不同相关。有研究认为抗SSA/Ro抗体对SSA/Ro抗原的 构型极其敏感，仅对天然60 000 SSA/Ro及变性的52 000 SSA/Ro起反应［8］。因而针对抗原不同蛋白组分的抗体基因序列会有较大差异。
在我们的研究中克隆P46没有重链V区基因，但也表现出与SSA/Ro抗原特异结合。有研究者发现有些抗体的重链V区单独也可以结合抗原，并从而提出分子量更小的单区抗体概念［9］，也有人提出仅仅CDR3本身就可能特异结合抗原。因此不能排除轻链可变区单独也可以结合抗原的可能。
噬菌体抗体库技术是一条获得单克隆抗体的有效途径，我们已经利用此技术成功地制备出单克隆的抗SSA/Ro 噬菌体抗体。下一步的工作是制备可溶性表达的scFv 抗体，进而检测不同表位的SSA/Ro抗原寡肽，或用荧光标记这些抗体再与机体不同器官组织反应，以确定抗不同表位的抗体与不同脏器免疫反应的特异性，从 而早期推断具有不同抗原表位抗体的患者可能会出现哪些脏器的损伤，以指导临床治疗。进一步增加单克隆抗体基因序列的测定，在较大样本量的基础上研究该抗体 基因与胚系基因的典型突变，可能揭示相关自身免疫病的发病机理，并进行基因修复治疗。另外，获得特异性抗SSA/Ro抗体，还为封闭抗体治疗相关疾病提供 了可能。
参考文献
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(收稿日期：2004-03-11)
(供稿编辑：刘小梅)
抗SSA抗体
[参考值]：阴性
[临床意义]：SS为干燥综合症的缩写，A为抗原序列号，又称抗RO抗体。SSA抗体在SS患者中阳性率为70-80%，合并SLE者为30-50%，单纯SLE者为8-10%，其他结缔组织病及少阳性